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《拉曼光譜儀應用在乳腺癌切除邊緣殘留中的快速判定》

    乳腺癌的手術切除中,準確區分癌變部位是否被完全切除是手術效果的關鍵性因素。早前科研人員已經證實激光拉曼光譜儀可以實時區分良性與惡性組織。
    如何有效地區分乳腺癌切除邊緣的健康組織與惡性組織?針對這個問題,來自哈維·穆德學院(Harvey Mudd College)的Willie C團隊[1]給出了解答,他們使用了必達泰克公司的i-Raman Ex(1064 nm)和i-Raman Plus(785 nm)兩種激發波長的便攜拉曼光譜儀系統,證實了拉曼光譜儀可以快速準確的區分健康組織和惡性組織,這是一種開拓性的腫瘤快速診斷技術。 
一、使用拉曼光譜儀測試的方案和光譜結果:
    必達泰克生產的這兩套拉曼系統的激發波長是在紅外線區域,能夠輕易穿透組織而不會造成損傷,并可在顯微鏡或手持式探頭的模式下操作(圖1),后續試驗中均控制兩個系統的總激光曝光(激光激發功率x收集時間)都等于9×103 mW-s。
    
圖1.  便攜拉曼系統與兩種采樣方式
二、使用拉曼光譜儀對腫瘤區與健康區進行區分:
    通過分析判斷出必達泰克的1064 nm拉曼系統有12個特征波段、785 nm系統有17個特征波段(圖2),由這些特征數據構成主成分分析(PCA)。依據算法處理不同組織的原始數據分別制成兩個拉曼系統的“差異光譜”(圖3),其代表了在健康組織與腫瘤組織之間的光譜差異。圖3中心軸上方的值表示該區域腫瘤拉曼活性大于健康組織。低于軸的值表示健康組織拉曼活性大于腫瘤細胞。
    使用PCA-LDA對組織區域的兩個光譜類別的識別,通過結果將其分為腫瘤(+)或健康(0)兩類。使用1064 nm拉曼系統測定57個組織靶標區域結果為:靈敏度= 86%、特異性= 96%、準確度= 91%(圖4)。使用785 nm拉曼系統測定40個組織靶標區域結果為:靈敏度= 95%、特異性= 100%、準確度= 96%(圖5)。
    從測試結果可以看出1064 nm拉曼系統擁有更低熒光干擾和更深采樣穿透深度,因此1064 nm拉曼系統在光譜差異性上更為優秀。而785 nm系統擁有的更高分辨率和更多光譜特征波段,實際測試結果能表現出更好的靈敏度、特異性和準確度。
   
圖2.  1064 nm拉曼系統(E)和785 nm拉曼系統(C)識別健康組織和癌變組織的特征光譜區域

圖3.  1064 nm拉曼系統(左)和785 nm拉曼系統(右)測得的正常細胞與癌變細胞的“差異光譜”

圖4.  1064 nm拉曼系統顯微下獲得的細胞類型分布圖與統計結果
圖5.  785nm拉曼系統顯微下獲得的細胞類型分布圖與統計結果
三、拉曼系統測定健康組織到腫瘤組織過度區域。
    腫瘤切除手術為了保證完全清除惡性組織,防止癌癥復發。腫瘤周圍的健康組織也會被去除。傳統上手術通過肉眼檢查組織來確定癌癥從何處開始以及健康組織的邊緣。但是,癌癥組織邊緣過渡區也可能含有癌細胞,這些癌細胞以肉眼無法觀察到的狀態與正常細胞共存。導致殘留下來的腫瘤細胞很可能會致使癌癥復發。因此,便攜拉曼系統是否可以比顯微觀察法更加有效的區分癌細胞與正常細胞混合區域顯得十分重要。
Willie C小組中的病理學家評估了整個癌癥切塊,將其區域分為健康,腫瘤或混合區域。使用785nm拉曼系統的探頭對直徑約為50-85μm的圓形區域進行采樣。實驗采用拉曼顯微鏡下測得4組數據作為對比,4次拉曼判別結果與醫學成像分析結果具有高度相關性(圖6),可認為判定基本準確可靠。
由于拉曼技術的目標應用是在外科手術過程中進行手持式腫瘤切緣檢查,因此該團隊在其工作中還探索了僅使用拉曼系統探頭(無顯微鏡),并且將數據收集時間限制在10秒以將惡性腫瘤與健康組織區分開的能力。
圖6.  拉曼測試與醫學評估的結果對照
四、使用拉曼系統探頭采集光譜并對組織進行分類
    從顯微鏡上取下i-Raman探頭后,可以將其手持在手術室中使用。借助儀器探頭自帶的嵌入式觸發器可啟動系統采集光譜,也可以將其固定在系統自帶小支架中(BAC150B,探頭支架)。其集成的XY工作臺,可系統地測試樣本數據和記錄XY坐標。
圖7.  785nm拉曼系統在無顯微下獲得的細胞類型分布圖與統計結果
    對于此實驗,使用固定的探頭支架和探頭配合采樣,限定采樣時長僅為10秒既獲取一次數據。切片組織使用拉曼探頭直接測得鑒定結果與醫學形態學分類的結果進行對比。從組織區域中57測試區域中最終結果為:靈敏度= 90%,特異性= 86%,準確度= 88%(圖7)。
由結果可以看出采用拉曼探頭直接采樣10秒所獲得的判斷結果不僅具有較高特異性、靈敏度和準確度。還能做到快速鑒別組織性質的作用,其有希望應用于外科切除手術中癌變組織邊緣的判斷。
五、檢測結果
    在這些實驗中必達泰克公司生產的i-Raman拉曼系統,高度整合的方案、輕巧的體積、靈活的采樣方式可以在空間有限的手術領域中使用。i-Raman拉曼系統的50-85μm光束尺寸非常適用于檢測15-20個簇集的腫瘤細胞。其優秀的儀器性能使客戶在10-90秒內即可獲得被測區域組織的拉曼診斷數據。
目前雖然拉曼技術較難直接取代乳腺癌的標準術后病理評估。但是通過Willie C小組的工作,我們多了一種快速、準確的乳腺癌手術切除邊緣的評估方法。這個方法將有可能大大降低患者術后復發和二次手術的概率。
參考文獻
[1] Zuniga, Willie C., et al. "Raman Spectroscopy for Rapid Evaluation of Surgical Margins during Breast Cancer Lumpectomy." Scientific Reports 9.1 (2019): 1-16.
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